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SiRNA实验

时间:2017-01-20 作者:市场部 文章来源: 浏览:1143

RNA干扰整体实验服务—SiRNA实验

第二部分:细胞培养、转染以及siRNA的筛选
一、细胞培养
使用10%胎牛 DMEM培养液,37℃下置于5%CO2培养箱中。待细胞融合至80%,用0.25%胰酶消化传代后接种(细胞密度5 XlO4)于培养瓶或孔板,待细胞融合至约70%后用于实验。以下图片均用显微镜100X拍照

YYYY细胞图片如下:




1)细胞培养方法:略
二、细胞转染
材料:YYYY细胞;XXXX基因siRNA(20Μm, 合成);Lipofectamine 2000试剂(使用前贮存在+4℃);Opti-MEM I 低血清培养基(使用前37℃预热);6孔组织培养板
转染步骤:使用Lipofectamine 2000转染siRNA。转染前一天,4-5×104细胞接种在6孔板上,2mL含FBS的基础培养基;选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70%;按照如下的方法准备siRNA- Lipofectamine 2000复合物:a。以250ul Opti-MEM I稀释5ul Lipofectamine 2000,轻轻混匀,室温下孵育5分钟。b。以250ulOpti-MEM I稀释250pmol siRNA,轻轻混匀。c。孵育5分钟后,混合稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine 2000,轻轻混合,在室温下孵育20分钟,以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊,但是这不会影响转染;将siRNA - Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合;6小时后进行FAM-siRNA荧光检测转染率;37℃,CO2培养箱孵育48小时,进行WB,real-time检测。
转染效率检测:




 


荧光镜下视野                                                   光镜下视野


通过荧光镜下视野与光镜下视野对比可知,细胞的转染效率达到70%以上可以进行后续的WB real-time检测。



三、siRNA最佳浓度筛选
实验分组:A 正常组;B 阴性对照组;C XXXX-1转染组;D XXXX-2转染组;E XXXX-3转染组
第一个筛选实验:荧光定量PCR实验
实验分组:


NO

样本编号

1

A

2

B

3

C

4

D

5

E


实验试剂:Trizol, Invitrogen ,#15596-026;RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631;Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521;RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381;SYBR GreenPCR Master Mix,ABI 4309155;Realtime-PCR仪,ABI 7900型;引物由primer3。0软件设计,并由艾柏森生物合成。步骤(略)。
结果数据:Ct(基本循环数);ΔCt(基本循环与内参循环数差值);ΔΔCt*(最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值);2-ΔΔCt(RQ) :目的基因mRNA相对含量(* 相对定量以含量最低的样本为标准,其余各样本的含量均为相对该样本的倍数。具体方法参见Kenneth,et al。 (2001) METHODS 25, 402–408)。
扩增曲线:在实时荧光PCR扩增反应中,荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段:基线期,指数期初期,指数期,平台期,在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线,阴性对照(模板为水)无显著荧光信号,提示荧光定量PCR反应程序正常运行,目的基因得到有效扩增,实验操作规范,试剂符合实验要求。
熔点曲线:从软件中显示形状只有一个峰值,没有出现杂峰,提示无非特异性荧光信号,目的基因扩增产物单一,有利于结果分析。



Sample

CT

ΔCт

ΔΔCт

RQ

RQ mean

SD

1

26。1312

5。7691

-2。2238

4.6712

4。4587

0.6585

1

26。3320

6.0975

-1.8954

3.7203



1

26.0145

5。6754

-2。3175

4.9847



2

27.0101

5。9786

-2.0143

4.0398

3.9841

0.0485

2

27.0077

6。0073

-1.9856

3.9603



2

27。0584

6。0103

-1。9826

3.9520



3

28.1032

8。3378

0。3449

0.7874

0.5186

0。2327

3

28。7212

9。3670

1.3741

0.3858



3

28。5034

9.3785

1.3856

0.3827



4

28.0210

7.8063

-0.1866

1.1381

1。3224

0.2119

4

28.0042

7.6421

-0.3508

1.2753



4

27。9142

7.3570

-0.6359

1.5539



5

26.3742

7.0578

-0。9351

1。9120

2.1770

0.3723

5

26。5004

6.6129

-1.3800

2.6027



5

26。6316

6.9812

-1。0117

2.0163



1-内参

20.3621


1-内参

20.2345


1-内参

20。3391


2-内参

21.0315


2-内参

21。0004


2-内参

21。0481


3-内参

19。7654


3-内参

19.3542


3-内参

19。1249


4-内参

20.2147


4-内参

20.3621


4-内参

20.5572


5-内参

19。3164


5-内参

19。8875


5-内参

19.6504



第二个筛选实验:WB实验
实验试剂:略
WB实验操作流程:略

实验结果:阳性条带以Gel pro4。0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。




Lanes:

Lane  1

Lane  2

Lane  3

Lane  4

Lane  5

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

XXXX

216。21

200.86

60。691

124。52

166.52

GAPDH

299.62

295.32

293.13

307。85

312.45

样本

A

B

C

D

E


以上实验得出XXXX-1干预效果最好,可选择做后续实验。

第三部分:细胞增殖、细胞黏附功能、细胞侵袭、细胞迁移实验
实验分组:A  正常细胞培养组;B  XXXX-1干预组

一、MTT方法检测细胞毒性
原理:MTT分析法以代谢还原噻唑蓝3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶,可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲月赞(Formazan),死细胞此酶消失,MTT不被还原。 用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在570nm(450nm)波长处检测光密度。
操作步骤:在96孔板加入细胞100μL/孔(约1×104),置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时;加入适当浓度的受试化合物;将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间;将5×MTT用 DilutionBuffer稀释成1× MTT;每孔加50μL 1× MTT,在37℃孵育4小时,使MTT还原为甲月赞;吸出上清液,每孔加150μL DMSO使甲月赞溶解,用平板摇床摇匀;酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
结果分析:细胞存活率% =(加药细胞OD-本地OD/对照细胞OD-本地OD)×100%。注:本底OD值(完全培养基加MTT,无细胞)


0h 570nm波长各孔OD值:

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0。457

0。452

0.463

0.457

B

0。461

0.448

0.454

0.454

本底

0.007

0.009

0。010

0.009


12h 570nm波长各孔OD值:

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0。503

0.518

0.511

0.511

B

0.494

0.501

0。489

0。495

本底

0.009

0.012

0.011

0.011


24h 570nm波长各孔OD值:

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0。618

0.607

0.624

0.616

B

0.573

0.566

0.584

0.574

本底

0.007

0.008

0.008

0.008


48h 570nm波长各孔OD值:

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.744

0.765

0.738

0.749

B

0.636

0.663

0。657

0。652

本底

0。009

0.008

0。008

0。008


72h 570nm波长各孔OD值:


实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.821

0。817

0.834

0.824

B

0.701

0.724

0。695

0.707

本底

0.013

0.008

0.009

0.010




二、细胞粘附能力实验
试剂耗材及仪器设备:结晶紫染色液;1×PBS, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》;仪器:美国bio-rad公司酶标仪 #680
操作步骤:采用结晶紫染色法测定。将Fn和Ln用1×PBS液分别稀释成100μg/ml和200μg/ml,以每孔100μl分别包被96孔板;37℃包被2h,用1×PBS洗涤2次,再用1% BSA封闭2h。;将各组细胞按常规方法收集后用无血清培养基制成单细胞悬液,每个样本计数3次取平均数,调节细胞浓度为3×105个/ml,以每孔200μl加入包被好的培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中孵育2h;取出96孔板,轻轻洗去未粘附的细胞,每孔用100μl 4%中性甲醛固定,30分钟后洗去;每孔加100μl 0.5%结晶紫,室温染色2h,,蒸馏水洗涤一次,阴干后每孔加入100μl 2% SDS溶液,放置酶标仪中570nm波长测定各孔OD值。
检测结果:

0h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.586

0.563

0。592

0.580

B

0.575

0.580

0.577

0.577


Fn OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.649

0.633

0.654

0.645

B

0。627

0.641

0.638

0.635


12h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.594

0。584

0.571

0。583

B

0。546

0.543

0.558

0。549


Fn OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0。656

0。639

0.643

0.646

B

0。609

0。611

0.603

0。608


24h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0。602

0.591

0.603

0。599

B

0.511

0.508

0.502

0.507


Fn OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.671

0.665

0。653

0。663

B

0.563

0.574

0.585

0.574


48h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.575

0.582

0.586

0。581

B

0.474

0.463

0.481

0.473


Fn OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.648

0。659

0.661

0.656

B

0.521

0.516

0.534

0。524


72h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.569

0.573

0.568

0。570

B

0.392

0.407

0.384

0。394


Fn OD值

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.636

0.641

0.652

0.643

B

0。489

0.476

0。486

0.484


三、细胞侵袭实验
实验材料:Corning公司:Transwell6孔板,孔径8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制备:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl,置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
制备细胞悬液:消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培养基。上室加入细胞悬液,培养细胞。
结果统计:用棉签擦去基质胶和上室内的细胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分钟;

细胞计数:取5个视野于倒置显微镜观察照相(放大倍数400)
A  

平均107个细胞



B  

平均66个细胞


平均98个细胞


B  

平均54个细胞


A  

平均103个细胞


B  

平均61个细胞


四、细胞迁移实验
材料:Corning公司:Transwell6孔板,孔径8um。
制备细胞悬液:消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培养基;取细胞悬2ml加入Transwell小室;培养细胞:常规培养24h。
结果统计:用棉签擦去上室内的细胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分钟;细胞计数:取5个视野于倒置显微镜观察照相(放大倍数400)
A  

平均119个细胞


B

平均54个细胞


A   

平均115个细胞


平均52个细胞


A  

平均121个细胞


B  

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